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浅析心肌肌钙蛋白检测中cTnT和cTnI的选择


       时间:2018-06-26



心肌肌钙蛋白(cardiac troponin,cTn)是心肌组织损伤时可在血液中检测到的特异性高和敏感性好的标志物,是诊断急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)以及对心脏疾病进行危险分层目前公认最好的标志物,2012年ESC/ACCF/AHA/WHF众多国际组织推荐cTn作为AMI诊断的首选生化指标。cTn由心肌肌钙蛋白T(cTnT)、心肌肌钙蛋白I(cTnI)及心肌肌钙蛋白C(cTnC)三种亚单位所组成,心肌中的T和I结构不同于其他肌肉组织,所以目前用于诊断的是cTnT和cTnI。

1992年第一份肌钙蛋白I商业检测试剂在临床推广,不久肌钙蛋白T检测试剂也开始在临床应用,在随后十余年引发了一场旷日持久的大争论:到底cTnT和cTnI孰优孰劣?cTnT是罗氏公司的专利产品,仅罗氏公司生产,最新一代高敏hs-cTnT试剂采用电化学发光法提高了检测敏感性,而其他大公司如雅培、西门子、贝克曼等也都推出了cTnI的高敏检测试剂,在检测敏感性上cTnI和cTnT无显著差异,都能鉴别出普通手段所不能检测出的心肌损伤。cTnI和cTnT的争论其实是两大商业公司阵营的争论。笔者是一个体外诊断行业的新手,试着从客观的角度来分析一下两者的优劣之处。

 

l cTn是什么


肌钙蛋白是肌肉收缩的调节蛋白,附在收缩的横纹肌细微组织上,心肌肌钙蛋白由肌钙蛋白T(cTnT)、肌钙蛋白I(cTnI)及肌钙蛋白C(cTnC)三种亚单位组成。cTnC有四个能结合钙离子的结合点,当它与细胞内的钙离子结合时,能导致整个肌钙蛋白构造上的变化。肌钙蛋白放松了肌动球蛋白,让肌动球蛋白与肌浆球蛋白互起作用,而造成肌肉收缩。cTnI,不论有钙无钙,它都可以阻止肌动蛋白和肌球蛋白的相互作用,并抑制肌动球蛋白的ATP酶活力。cTnT与原肌球蛋白结合。这三种成分之间存在着钙依赖性的相互作用,三者结合通过钙控制肌肉的收缩。


5%-8%的cTnT分布于心肌细胞胞浆,为游离的胞浆蛋白,92%~95%结合于细肌丝中,为结合的结构蛋白;3%的cTnI分布于心肌细胞胞浆中,97%与心肌结构蛋白结合。当心肌细胞因缺血缺氧等因素遭破坏时,游离型cTnI和cTnT可首先迅速从细胞中释放入血,随后结合于心肌结构蛋白中的结合型cTnI和cTnT逐渐分解,缓慢释放入循环血中,从而解释了以心肌细胞受损为表现的疾病,如急性心肌梗死(AMI),cTnI和cTnT在循环血中较早出现并能持续较长时间的原因。

 

l 时间维度上cTnT要略优于cTnI


cTnT、cTnI由于分子量小,分别为37kD和24kD,所以发病后血中浓度迅速升高,心肌细胞损伤后,游离cTnT较早释放形成第一个峰,随后结合于肌纤维中的cTnT逐渐释放而出现第二个峰;由于细胞液中的含量较少,cTnI释放通常只有一个峰。cTnT一般在心肌损伤后3~6h外周血中出现增高,最高值在12~24h,增高可持续10~14天;cTnI一般在心肌损伤后3~6h外周血中出现增高,14~20h达到峰值,增高可持续7~10天。上述时间点虽然不同研究结果略有不同,但总体来说cTnT比cTnI出现增高时间接近,持续时间更长,检测的窗口期cTnT更长。

 

l 稳定性上cTnT要优于cTnI


cTn释放入血后,cTnT主要以完整的单体存在。cTnI初以cTnI-cTnC复合体存在,然后分解为多种cTnI片段,极少以cTnI完整的单体存在,且极易受磷酸化、氧化等影响,以氧化型、还原型、磷酸化、去磷酸化、蛋白降解形式释放。cTnI分子的氨基端和羧基端很容易因蛋白质水解而降解,并产生多达8种降解产物,因此,cTnI分子在检测时很容易降解,直接影响测定结果。相较之下,cTnI分子的中心区域第30~110氨基酸残基可能受TnC的保护而表现较为稳定,应用针对该区段的抗体测定cTnI,在一定程度上可减少cTnI分子降解而对结果造成的影响。但有研究显示其还是会受许多干扰因素影响,主要为相对分子质量50~200 000的各种抗体成分,封闭了cTnI 30~110区段的抗体结合位点。cTnl的第22位和第23位的丝氨酸易受蛋白激酶A作用发生磷酸化反应,cTnI的第79位和第96位的半胱氨酸容易发生氧化反应或还原反应,从而改变cTnl的分子结构形式和抗原性,以致影响某些抗体的识别能力,出现假阴性结果。因此,从检测的稳定性来考虑,cTnT要比cTnI更稳定。

 

l 特异性上cTnI要略优于cTnT


cTnT和cTnI都存在心肌型和骨骼肌型同源的情况。cTnI的序列和慢骨骼肌肌钙蛋白I约有40%同源,和快骨骼肌肌钙蛋白I少于40%;而cTnT和慢、快骨骼肌肌钙蛋白T的同源性分别为58.3%和56.6%。从序列差异性来看cTnI更好一些,而且其氨基末端比骨骼肌型多31个额外的氨基酸残基,使其更容易制备特异性单克隆抗体。罗氏公司初期的cTnT检测试剂就存在非特异性地与骨骼肌cTn结合的缺陷,而后第2、3代cTnT检测试剂分别通过cTnT抗体纯化、cTnT抗体人源化解决了非特异性问题,新一代高敏感方法hs-cTnT试剂以两株进行改良过的cTnT单克隆抗体,采用电化学发光法,其检测下限提高10倍,交叉反应问题也得到进一步控制,可见特异性的问题是可以通过技术优化而改良的。


早期cTnI阵营曾提出cTnT 在肾衰及各种肌病病人中有非特异性增加,但随即cTnT阵营也有研究表明慢性肾功能不全心肌微损害也同样会引起cTnI增高。cTnT和cTnI都是大分子物质,只有在心肌坏死时释放肌钙蛋白,释放的肌钙蛋白部分经过网状内皮系统清除,部分在肾脏中清除,游离cTnT在循环中生物半衰期为 120min,游离cTnI在循环血中的半衰期为67min。笔者认为肾功能受损可能会引起cTnT碎片积聚,从而导致严重肾衰病人出现血清cTnT水平升高,但cTnI同样也在肾中清除,肾功能受损也会引起cTnI水平升高,笔者推测可能cTnT比cTnI分子量大一点,而且cTnI本身不稳定也会被降解,肾功能下降的影响cTnT相对高了一点。但多数学者认为, 血清肌钙蛋白升高来源于心脏, 是各种原因引起的心肌微损伤或微梗死, 导致心肌cTnT与cTnI释放入血清的结果, 是不良心血管事件及死亡危险的独立预测因素。

 

l 标准化上cTnT要明显优于cTnI


cTnT是罗氏公司(Roche Diagnostics)的专利产品,仅罗氏公司生产,目前垄断着世界范围内cTnT的检测,标准化和一致性问题相对较小。而其他厂商限于专利问题只能生产cTnI相关的产品,由于检测方法(检测抗体)不同,标准化和一致性存在一定困难。目前 FDA 至少已批准 8 家生产厂商的共 16 种 cTnI 检测试剂,临床应用中发现,这些cTnI检测试剂测定值之间存在着差异,不同的cTnl分析方法对同一份标本的检测值最大可相差30余倍。


各厂家捕获(capture,C)和检测(detection,D)单克隆抗体所识别的抗原决定簇氨基酸残基有所不同,如Abbott Architect(C:87-91,24-40;D:41-49)、Abbott i-STAT(C:41-49,88-91:D:28-39;62-78)、Beckman Access AccuTnI(C:41-49;D:24-40)、Ortho Vitros Eci ES(C:24-40,41-49;D:87-91)、Roche Elecsys TnT Gen4(C:136-147;D:125-131)。而且各试剂厂家使用捕获和检测抗体个数不一致,有1+1、2+1、2+2模式。不同的抗原表位导致检测结果差异较大,不具有可比性,且cTnI易被降解及氧化磷酸化,不同降解片段及磷酸化等形式与抗体的反应性亦不同。《高敏感方法检测心肌肌钙蛋白临床应用中国专家共识(2014)》中就明确提出:不同的cTnI(包括hs-cTnI)检测结果之间存在差异,难以相互比较,临床应用时应充分注意。

 

l cTnT和cTnI的选择

临床应用研究表明,cTnI和cTnT两者的临床应用价值基本相同,都能鉴别出微小的心肌损伤,在特异性上cTnI略有胜出,而在稳定性及标准化等其他方面cTnT更为突出,并且普遍认为对长期预后预测的准确性,cTnT优于cTnI。各个厂家选择cTnI还是cTnT都没有问题,只是顾忌罗氏公司的cTnT专利保护,不得不选择cTnI。然而罗氏公司的cTnT专利保护即将到期(美国专利2020年到期,欧洲日本专利已经到期),其他厂家也不会看着这块市场一家独大,届时到底cTnI和cTnT孰优孰劣就由市场来揭晓。




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